農用微生(shēng)物菌劑（GB 20287-2006）
前 言
本标準的5.1、5.3和第8章(zhāng)條文爲強制性條款，其餘爲推薦性條款。
本标準的附錄A、附錄C和附錄D爲規範性附錄，附錄B爲資料性附錄。
農用微生(shēng)物菌劑
1 範圍
本标準規定了農用微生(shēng)物菌劑（即微生(shēng)物接種劑）的術(shù)語和定義、産品分(fēn)類、要求、試驗方法、檢驗規則、包裝、标識、運輸和貯存。
本标準适用于農用微生(shēng)物菌劑類産品。
2 規範性引用文件(jiàn)（略）
3 術(shù)語和定義（略）
4 産品分(fēn)類
産品按劑型可(kě)分(fēn)爲液體(tǐ)、粉劑、顆粒型；按内含的微生(shēng)物種類或功能特性可(kě)分(fēn)爲根瘤菌菌劑、固氮菌菌劑、解磷類微生(shēng)物菌劑、矽酸鹽微生(shēng)物菌劑、光(guāng)合細菌菌劑、有機(jī)物料腐熟劑、促生(shēng)菌劑、菌根菌劑、生(shēng)物修複菌劑等。
5 要求
5.1 菌種
生(shēng)産用的微生(shēng)物菌種應安全、有效。生(shēng)産者應提供菌種的分(fēn)類鑒定報告，包括屬及種的學名、形态、生(shēng)理(lǐ)生(shēng)化特性及鑒定依據等完整資料。生(shēng)産者應提供菌種安全性評價資料。采用生(shēng)物工(gōng)程菌，應具有允許大(dà)面積釋放(fàng)的生(shēng)物安全性有關批文。
5.2 産品外觀（略）
5.3 産品技術(shù)指标
5.3.1 農用微生(shēng)物菌劑産品的技術(shù)指标見(jiàn)表1，其中有機(jī)物料腐熟劑産品的技術(shù)指标按表2執行。
表1 農用微生(shēng)物菌劑産品的技術(shù)指标
|
項 目 |
劑 型 |
|||
|
液 體(tǐ) |
粉 劑 |
顆 粒 |
||
|
有效活菌數(cfu)a ，億/g(mL) |
≥ |
2.0 |
2.0 |
1.0 |
|
黴菌雜菌數，個/g(mL) |
≤ |
3.0×106 |
3.0×106 |
3.0×106 |
|
雜菌率， % |
≤ |
10.0 |
20.0 |
30.0 |
|
水分(fēn)，% |
≤ |
- |
35.0 |
20.0 |
|
細度，% |
≥ |
- |
80 |
80 |
|
pH值 |
|
5.0~8.0 |
5.5~8.5 |
5.5~8.5 |
|
保質期b，月 |
≥ |
3 |
6 |
|
|
a 複合菌劑，每一種有效菌的數量不得(de)少于0.01億/g(mL)；以單一的膠質芽胞杆菌（Bacillus mucilaginosus）制成的粉劑産品中有效活菌數不少于1.2億/g。 b 此項僅在監督部門(mén)或仲裁雙方認爲有必要時檢測。 |
||||
表2 有機(jī)物料腐熟劑産品的技術(shù)指标
|
項目 |
劑 型 |
|||
|
液 體(tǐ) |
粉 劑 |
顆 粒 |
||
|
有效活菌數(cfu)， 億/g(mL) |
≥ |
1.0 |
0.50 |
0.50 |
|
纖維素酶活a，U/g（mL） |
≥ |
30.0 |
30.0 |
30.0 |
|
蛋白(bái)酶活b，U/g(mL) |
≥ |
15.0 |
15.0 |
15.0 |
|
水 分(fēn)，% |
≤ |
- |
35.0 |
20.0 |
|
細 度，% |
≥ |
- |
70 |
70 |
|
pH值 |
|
5.0～8.5 |
5.5～8.5 |
5.5～8.5 |
|
保質期c，月 |
≥ |
3 |
6 |
|
|
a 以農作(zuò)物稭稈類爲腐熟對象測定纖維素酶活。 b 以畜禽糞便類爲腐熟對象測定蛋白(bái)酶活。 c 此項僅在監督部門(mén)或仲裁雙方認爲有必要時檢測。 |
||||
5.3.2 農用微生(shēng)物菌劑産品中無害化指标見(jiàn)表3。
表3 農用微生(shēng)物菌劑産品的無害化技術(shù)指标
|
參數 |
|
标準極限 |
|
糞大(dà)腸菌群數，個/g(mL) |
≤ |
100 |
|
蛔蟲卵死亡率，% |
≥ |
95 |
|
砷及其化合物（以As計(jì)），mg/kg |
≤ |
75 |
|
镉及其化合物（以Cd計(jì)），mg/kg |
≤ |
10 |
|
鉛及其化合物（以Pb計(jì)），mg/kg |
≤ |
100 |
|
鉻及其化合物（以Cr計(jì)），mg/kg |
≤ |
150 |
|
汞及其化合物（以Hg計(jì)），mg/kg |
≤ |
5 |
6 試驗方法
6.1 儀器設備（略）
6.2 試劑（略）
6.3 産品參數的檢測
6.3.1 外觀(感官)的測定
取少量樣品放(fàng)到白(bái)色搪瓷盤(或白(bái)色塑料調色闆)中，仔細觀察樣品的顔色、形狀、質地。
6.3.2 有效活菌數的測定
采用平闆計(jì)數法，根據所測微生(shēng)物的種類選用适宜的培養基。
若采用最大(dà)可(kě)能數（Most Probable Number，MPN）5管法，遵照(zhào)附錄C的規定。
6.3.2.1 系列稀釋
稱取樣品10 g（精确到0.01 g），加入帶玻璃珠的100 mL的無菌水中(液體(tǐ)菌劑取l0.0 mL加入90 mL的無菌水中)，靜(jìng)置20 min，在旋轉式搖床上200 r/min充分(fēn)振蕩30 min，即成母液菌懸液（基礎液）。
用無菌移液管分(fēn)别吸取5.0mL上述母液菌懸液加入45 mL無菌水中，按1:10進行系列稀釋，分(fēn)别得(de)到1:1×101，1:1×102，1:1×103，1:1×104……稀釋的菌懸液（每個稀釋度應更換無菌移液管）。
6.3.2.2 加樣及培養
每個樣品取3個連續适宜的稀釋度，用無菌移液管分(fēn)别吸取不同稀釋度菌懸液0.1 mL，加至預先制備好的固體(tǐ)培養基平闆上，分(fēn)别用無菌玻璃刮刀将不同稀釋度的菌懸液均勻地塗于瓊脂表面。
每一稀釋度重複3次，同時以無菌水作(zuò)空白(bái)對照(zhào)，于适宜的條件(jiàn)下培養。
6.3.2.3 菌落識别
根據所檢測菌種的技術(shù)資料，每個稀釋度取不同類型的代表菌落通過塗片、染色、鏡檢等技術(shù)手段确認有效菌。當空白(bái)對照(zhào)培養皿出現菌落數時，檢測結果無效，應重做。
6.3.2.4 菌落計(jì)數
以出現20~300個菌落數的稀釋度的平闆爲計(jì)數标準（絲狀真菌爲10~150個菌落數），分(fēn)别統計(jì)有效活菌數目和雜菌數目。當隻有一個稀釋度，其平均菌落數在20～300個之間時，則以該平均菌落數計(jì)算。若有兩個稀釋度，其平均菌落數均在20～300個之間時，應按兩者菌落總數之比值決定。若其比值小于等于2應計(jì)算兩者的平均數；若大(dà)于2則以稀釋度小的菌落平均數計(jì)算。有效活菌數按式（1）或式（2）計(jì)算：
nm = kv1/(m0v2) ×10-8 …………………（1）
nv =kv1/(v0v2) ×10-8 …………………（2）
式中：
nm — 質量有效活菌數， 億/g
nv — 體(tǐ)積有效活菌數， 億/mL
— 菌落平均數， 個
k — 稀釋倍數
v1 — 基礎液體(tǐ)積， mL
v2 — 菌懸液加入量， mL
v0 — 樣品量， mL
m0 — 樣品量， g
6.3.3 黴菌雜菌數的測定
采用馬丁培養基，測定方法同6.3.2。
6.3.4 雜菌率的測定
除樣品有效菌外其它的菌均爲雜菌。樣品中雜菌率按式（3）計(jì)算：
m = n1/(n1+n)×100 …………………（3）
式中：
m — 樣品雜菌率， %
n1 — 雜菌數， 億/g(mL)
n — 有效活菌數， 億/g(mL)
6.3.5 水分(fēn)的測定
将空鋁盒置于幹燥箱中105 ℃±2 ℃烘幹 0.5 h，冷(lěng)卻後稱量記錄空鋁盒的質量。然後稱取2份平行樣品（顆粒型樣品，應先粉碎過1.0 mm試驗篩），每份20 g（精确到0.01 g），分(fēn)别加入鋁盒中并記錄質量。将裝好樣品的鋁盒置于幹燥箱中105 ℃±2 ℃下烘幹4 h~6 h。取出置于幹燥器中冷(lěng)卻20 min後進行稱量。水分(fēn)含量按式（4）計(jì)算（結果爲兩次測定的平均值）：
w = (m1- m2)/( m1- m0) ×100 …………………（4）
式中：
w — 樣品水分(fēn)含量， %
m0 — 空鋁盒的質量， g
m1 — 樣品和鋁盒的質量， g
m2 — 烘幹後樣品和鋁盒的質量， g
6.3.6 細度的測定
6.3.6.1 粉劑樣品
稱取樣品50 g（精确到0.1 g），放(fàng)入300 mL燒杯中，加200 mL水浸泡10 min~30 min後倒入孔徑0.18 mm的試驗篩中，然後用水沖洗，并用刷子輕輕地刷篩面上的樣品，直至篩下流出清水爲止。将試驗篩連同篩上樣品放(fàng)入幹燥箱中，在105 ℃±2 ℃烘幹4 h ~6 h。冷(lěng)卻後稱量篩上樣品質量。樣品細度按式（5）計(jì)算：
s ={1- m1/[ m0（1-w）]} ×100 …………………（5）
式中：
s — 篩下樣品質量分(fēn)數， %
m0 — 樣品質量， g
w — 樣品含水量， %
m1 — 篩上幹樣品質量， g
6.3.6.2 顆粒樣品
稱取樣品50 g（精确到0.1 g），将兩個不同孔徑的試驗篩（1.0 mm和4.75 mm）摞在一起放(fàng)在底盤上(大(dà)孔徑試驗篩放(fàng)在上面)。樣品倒入大(dà)孔徑試驗篩内篩樣品，然後稱小孔徑試驗篩上的樣品質量。顆粒細度按式（6）計(jì)算：
g = m1 /m0 ×100 …………………（6）
式中：
g — 樣品質量分(fēn)數， %
m1 — 小孔徑試驗篩上樣品質量，g
m0 — 樣 品 質 量， g
6.3.7 pH值的測定
打開酸度計(jì)電源預熱(rè)30 min，用标準溶液校(xiào)準。
pH值的測定，每個樣品重複三次，計(jì)算三次的平均值。
6.3.7.1 液體(tǐ)樣品
用量筒取40mL樣品放(fàng)入50 mL的燒杯中，直接用酸度計(jì)測定，儀器讀(dú)數穩定後記錄。
6.3.7.2 粉劑樣品
稱取樣品15 g，放(fàng)入50 mL的燒杯中，按1:2(樣品:無離(lí)子水)的比例将無離(lí)子水加到燒杯中(如(rú)果樣品含水量低，可(kě)根據基質類型按1:3~1:5的比例加無離(lí)子水)，攪拌均勻。然後靜(jìng)置30 min，測樣品懸液的pH值，儀器讀(dú)數穩定後記錄。
6.3.7.3 顆粒樣品
樣品先研碎過1.0 mm試驗篩，按照(zhào)6.3.7.2的方法測定。
6.3.8 糞大(dà)腸菌群數的測定
應符合GB/T 19524.1《肥料中糞大(dà)腸菌群的測定》的規定。
6.3.9 蛔蟲卵死亡率的測定
應符合GB/T 19524.2《肥料中蛔蟲卵死亡率的測定》的規定。
6.3.10 纖維素酶活、蛋白(bái)酶活的測定
應符合附錄D的規定。
6.3.11 砷、镉、鉛、鉻、汞的測定
應符合GB 18877—2002中的5.12~5.17的規定。
6.3.12 保質期的檢驗
在産品說(shuō)明書(shū)标明的保質期前，按6.3.1~6.3.11方法測定産品相(xiàng)應指标。
7 檢驗規則
本标準中産品技術(shù)指标的數字修約應符合GB 8170的規定；産品質量合格判定應符合GB 1250中修約值比較法的規定。
7.1 抽樣
按每一發酵罐菌液（或每批固體(tǐ)發酵）加工(gōng)成的産品爲一批，進行抽樣檢驗，抽樣過程嚴格避免雜菌污染。
7.1.1 抽樣工(gōng)具
無菌塑料袋(瓶)，金屬勺、抽樣器、量筒、牛皮紙袋、膠水、抽樣封條及抽樣單等。
7.1.2 抽樣方法和數量
一般在成品庫中抽樣，采用随機(jī)法抽取。
抽樣以件(jiàn)爲單位，小包裝以每一包裝箱爲一件(jiàn)。随機(jī)抽取3~5件(jiàn)，每件(jiàn)中随機(jī)抽取一袋(瓶)；若每袋(瓶)包裝小于500 g（mL）的産品，應多抽幾件(jiàn)。大(dà)包裝産品以一袋(桶)爲一件(jiàn)，随機(jī)抽取5~10件(jiàn)，在無菌條件(jiàn)下，每件(jiàn)取樣500 g(mL)，然後将抽取樣品混勻，按四分(fēn)法分(fēn)裝3袋(瓶)，每袋（瓶）不少于500 g(mL)。
7.2 檢驗分(fēn)類（略）
7.3 判定規則
7.3.1 具下列任何一條款者，均爲合格産品
a. 檢驗結果各項技術(shù)指标均符合标準要求的産品；
b. 在産品的外觀、水分(fēn)、細度、pH值等檢測項目中，有1項不符合要求，而其它各項技術(shù)指标符合要求的産品。
7.3.2 具下列任何一條款者，均爲不合格産品
a. 有效活菌數不符合技術(shù)指标；
b. 黴菌雜菌數不符合技術(shù)指标；
c. 雜菌率不符合技術(shù)指标；
d. 糞大(dà)腸菌群不符合技術(shù)指标；
e. 蛔蟲卵死亡率不符合技術(shù)指标；
f. 砷、镉、鉛、鉻、汞中任一含量不符合技術(shù)指标；
g. 有機(jī)物料腐熟劑産品中所測酶活不符合技術(shù)指标；
h. 在外觀、水分(fēn)、細度、pH值等檢測項目中，有2項（含）以上不符合要求。
8 包裝、标識、運輸和貯存
參見(jiàn)NY 885-2004《農用微生(shēng)物産品标識要求》
附 錄 A 常用檢測培養基
參見(jiàn)NY/T 1114-2004《微生(shēng)物肥料實驗用培養基技術(shù)條件(jiàn)》
附 錄 B
（資料性附錄）
常用染色劑
B.1 革蘭氏染色劑
B.1.1 結晶紫染色液（Hucker氏配方）
甲液：結晶紫（Crystal violet） 2.0 g
乙醇(95%) 20.0 mL
乙液：草酸铵[(NH4)2C2O4•H2O] 0.8g
蒸餾水 80.0 mL
甲、乙兩液相(xiàng)混，過濾，棕色瓶保存。
B.1.2 盧哥(Lugol)氏碘液
碘(I2)片 1.0 g
碘化鉀(KI) 2.0 g
蒸餾水 300 mL
先溶碘化鉀于少量蒸餾水中，再将碘溶于碘化鉀溶液中，可(kě)稍加熱(rè)，最後加足蒸餾水，棕色瓶保存。
B.1.3 脫色液 95%的乙醇液。
B.1.4 複染液 0.5%的番紅(hóng)水溶液（Safranin O)
2.5%的番紅(hóng)酒精溶液 20 mL
蒸餾水 80 mL
B.2 芽胞染色液
B.2.1 孔雀綠染色液（Malachite green）
孔雀綠 5.0 g
蒸餾水 100 mL
B.2.2 0.5%番紅(hóng)染色液
B.3 石碳酸複紅(hóng)染色液
甲液：堿性複紅(hóng)(Basic fuchsin) 0.3 g
95%酒精 10.0 mL
乙液：石碳酸(Phenoecrystals C.P) 5.0 g
蒸餾水 95 mL
将甲、乙兩液混合後即得(de)石碳酸複紅(hóng)染色液原液。染色時，将原液稀釋5~10倍使用。
附 錄 C
（規範性附錄）
稀釋法（MPN 5管法）
C.1 稀釋
稱取樣品10.0 g，加入帶玻璃珠的100 mL的無菌水中(液體(tǐ)菌劑取l0.0 mL加入90 mL的無菌水中)，靜(jìng)置20 min，在旋轉式搖床上200 r/min充分(fēn)振蕩30 min，即得(de)到1×101稀釋度的菌懸液。
用無菌移液管吸取5.0mL上述菌懸液加入到裝有45mL無菌水的三角瓶中，充分(fēn)振蕩搖勻，得(de)到1×102稀釋度的菌懸液，依此方法制成1×103、1×104、1×105……稀釋度的菌懸液（每個稀釋度應更換無菌移液管）。
C.2 加樣
選擇适宜的5個連續稀釋度，用無菌移液管分(fēn)别吸取不同稀釋度的菌懸液1.0 mL，加到已準備好的盛有9.0 mL無菌培養基的螺口試管中，每一稀釋度重複接5支試管（不同稀釋度間更換無菌移液管），同時用無菌培養液作(zuò)對照(zhào)。
C.3 培養
接種後立即擰緊塑料帽并搖勻，将接種好的試管放(fàng)到适宜的條件(jiàn)下培養。
C.4 計(jì)算
根據各稀釋系列試管中有無待測微生(shēng)物生(shēng)長或其生(shēng)理(lǐ)反應的正或負得(de)出數量指标，并在相(xiàng)應的MPN統計(jì)表中查出近似值（見(jiàn)表C1），即可(kě)計(jì)算出待測樣品的有效活菌數，以億個/mL或億個/g表示。
計(jì)算方法：
1mL（g）樣品中的有效活菌數=菌數近似值×數量指标第一位數的稀釋倍數
C.5 計(jì)數規則
在稀釋系列中必須最後一個稀釋度所有重複間都(dōu)沒有微生(shēng)物生(shēng)長。确定數量指标系取稀釋系列中所有重複都(dōu)有生(shēng)長(或是正反應)的最高稀釋度爲數量指标的第一位數字，總共取三個連續稀釋管的結果查表。
C.5.1 在全部5支試管中均出現生(shēng)長的稀釋度中，把出現生(shēng)長的稀釋度倍數最高的那一級放(fàng)入數列。例如(rú)：爲5-5-3-0-0時，則取5-3-0數列；
C.5.2 在全部5支試管中均不出現生(shēng)長的稀釋度中，把稀釋度倍數最低的那一級放(fàng)入數列。例如(rú)：爲5-3-0-0-0時，則取5-3-0數列；
C.5.3 如(rú)果應用上述兩條規則，會出現采用如(rú)5-5-4-3-0這樣的4個等級的稀釋度的情況。此時，可(kě)先取前面的5-4-3數列，後取4-3-0數列，分(fēn)别求出lgMPN，然後算出其真數的平均值。在此列中，數列5-4-3的lgMPN爲1.447，數列4-3-0的lgMPN爲0.431+1（後一數列與前一數列相(xiàng)應稀釋了10倍，故要加1進行校(xiào)正），（1.447+1.431）/2=1.439，所以MPN=27.5。
表C.1 MPN，lgMPN表
|
陽性試管數 |
MPN （相(xiàng)當于第一稀釋管1毫升） |
LgMPN |
陽性試管數 |
MPN （相(xiàng)當于第一稀釋管1毫升） |
LgMPN |
||||
|
第一 稀釋管 |
第二 稀釋管 |
第三 稀釋管 |
第一 稀釋管 |
第二 稀釋管 |
第三 稀釋管 |
||||
|
0 |
0 |
0 |
0 |
- |
5 |
0 |
0 |
2.3 |
0.362 |
|
0 |
1 |
0 |
0.18 |
0.255-1 |
5 |
0 |
1 |
3.1 |
0.491 |
|
1 |
0 |
0 |
0.20 |
0.301-1 |
5 |
1 |
0 |
3.3 |
0.519 |
|
1 |
1 |
0 |
0.40 |
0.602-1 |
5 |
1 |
1 |
4.6 |
0.663 |
|
2 |
0 |
0 |
0.45 |
0.653-1 |
5 |
2 |
0 |
4.9 |
0.690 |
|
2 |
0 |
1 |
0.68 |
0.833-1 |
5 |
2 |
1 |
7.0 |
0.845 |
|
2 |
1 |
0 |
0.68 |
0.833-1 |
5 |
2 |
2 |
9.5 |
0.978 |
|
2 |
2 |
0 |
0.93 |
0.968-1 |
5 |
3 |
0 |
7.9 |
0.898 |
|
3 |
0 |
0 |
0.78 |
0.892-1 |
5 |
3 |
1 |
11.0 |
1.041 |
|
3 |
0 |
1 |
1.1 |
0.041 |
5 |
3 |
2 |
14.0 |
1.146 |
|
3 |
1 |
0 |
1.1 |
0.041 |
5 |
4 |
0 |
13.0 |
1.114 |
|
3 |
2 |
0 |
1.4 |
0.146 |
5 |
4 |
1 |
17.0 |
1.230 |
|
4 |
0 |
0 |
1.3 |
0.114 |
5 |
4 |
2 |
22.0 |
1.342 |
|
4 |
0 |
1 |
1.7 |
0.230 |
5 |
4 |
3 |
28.0 |
1.447 |
|
4 |
1 |
0 |
1.7 |
0.230 |
5 |
5 |
0 |
24.0 |
1.380 |
|
4 |
1 |
1 |
2.1 |
0.322 |
5 |
5 |
1 |
35.0 |
1.544 |
|
4 |
2 |
0 |
2.2 |
0.342 |
5 |
5 |
2 |
54.0 |
1.732 |
|
4 |
2 |
1 |
2.6 |
0.415 |
5 |
5 |
3 |
92.0 |
1.964 |
|
4 |
3 |
0 |
2.7 |
0.431 |
5 |
5 |
4 |
160.0 |
2.204 |
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5 |
5 |
5 |
>180.0 |
>2.255 |
附 錄 D (略)
